Genetica dello Sviluppo
L’ argomento generale è lo studio dei fattori di trascrizione e molecole segnale rilevanti per lo sviluppo embrionale del cervello, della testa e degli arti. I nostri sistemi sperimentali combinano la genetica in vivo, colture d’organo, cellule staminali. Recentemente abbiamo esteso i nostri interessi ai profili trascrizionali e alla bioinformatica.
Gli argomenti specifici sono:
- il ruolo dei geni Dlx e p63 per lo sviluppo e la morfogenesi degli arti, alla luce della malattia congenital umana Split-Hand-Foot Malformation (SHFM)
- il pathway molecolare controllato da Dlx5 durante il differenziamento delle cellule neurali staminali a neuroni GABA+
- la regolazione molecolare dell’estensione assonale, guidance e connettività del sistema sensoriale olfattivo, e della migrazione dei neuroni GnRH, alla luce della malattia genetica Kallmann syndrome
- Sviluppo e maturazione delle network di neuroni inibitori GABAergici della corteccia cerebrale e ippocampo
I geni Dlx sono espressi all’apice delle appendici di tutte le specie animali, compresi gli arti embrionali. Nell’uomo, mutazioni o mis-organizzazioni genomiche di DLX5 e DLX6 causano la malformazione SHFM tipo 1. Abbiamo precedentemente pubblicato che la eliminazione combinata di Dlx5+Dlx6 nel topo causa la stessa malformazione, aprendo quindi la possibilità di studiare i determinanti cellulari e molecolari di questa malattia.
Ci stiamo focalizzando sulla network regolativa che comprende Dlx5;Dlx6 e p63, un fattore di trascrizione essenziale per il mantenimento delle cellule staminali epidermiche e la loro stratificazione. Mutazioni di p63 nell’uomo causano le malformazioni SHFM tipo 4 e la EEC. In collaborazione con la Dr.ssa Guerrini (Univ. Milano) e il Dr. Costanzo (Univ. Roma) abbiamo dimostrato che p 63 regola Dlx5;Dlx6, i quali regolano a loro volta FGF8 e Wnt5a. FGF8 promuove la stabilità di p63 in quanto antagonizza la isomerasi Pin1, che tende a degradare p63. Il ruolo di Wnt5a è ancora da chiarire.
Crediamo che i modelli animali di SHFM e EEC offrano l’ opportunità unica di ottimizzare delle procedure di trasferimento genico mediante AAV ai tessuti embrionali, prima in colture d’organo ex-vivo, poi direttamente in utero. Stiamo esplorando questa possibilità in collaborazione con il Dr. Auricchio (TIGEM, Pozzuoli). Un risultato positivo sarebbe essenziale per affermare che, in principio, una malattia genetica dello sviluppo potrebbe essere corretta già in utero.
I geni Dlx sono espressi secondo un ordine spaziale e temporale nelle aree neurogeniche del cervello embrionale e adulto, deputate alla genesi dei neuroni inibitori GABAergici. Sono anche espressi negli stessi neuroni durante il differenziamento e nella vita adulta. In assenza di Dlx5 si osserva una riduzione dei neuroni CR e TH positivi (GABAergici) delle regioni olfattive del cervello neonatale. Utilizzando il modello neurosfere e il modello NS aderenti per espandere i progenitori neurali, abbiamo visto che questi progenitori Dlx5-/- mostrano un ridotto potenziale differenziativo, quindi Dlx5 controlla un passaggio critico del differenziamento precoce interneuronale.
Intendiamo chiarire la signature molecolare del differenziamento GABAergico e comprendere il ruolo di Dlx5 in questo processo. I profili trascrizionali delle neurosfere Dlx5-/- hanno individuato Wnt5a come target di Dlx5 capace di promuovere il differenziamento GABAergico. Abbiamo validato questa regolazione funzionalmente, usando sia colture primarie di neuroni corticali che cellule NS aderenti, le quali ricapitolano il differenziamento GABA+ in vitro. Al momento stiamo indagando sulla funzione di Dlx5 negli interneuroni adulti corticali e ippocampali, utilizzando tecnologie cre-lox per l’inattivazione condizionale (in collaborazione con Dr. Levi, CNRS Parigi). I risultati verranno combinati con dati provenienti da single-cell RNAseq di neuroni corticali (con Dr. Zecchina Politecn. Torino).
Una nuova linea di indagine, in collaborazione con Dr. Hirsch (Univ. Torino) riguarda il ruolo della GTPasi Rac1 per la migrazione, maturazione e attività elettrica degli interneuroni corticali e ippocampali
Durante lo sviluppo embrionale, i neuroni olfattivi immaturi proiettano il loro assone verso il cervello anteriore a forma le prime connessioni. Allo stesso tempo i neuroni GnRH migrano dal placode verso la regione olfattiva del cervello, e da li all’ipotalamo dove svolgono un ruolo centrale nella maturazione sessuale, gametogenesi e riproduzione. Questo processo è difettoso nella Malattia di Kallmann, una condizione congenita di ipogonadismo centrale e incapacità di percepire gli odori.
Anche se molti geni associati alla malattia di Kallmann sono noti, i meccanismi di guidance assonale e di migrazione dei neuroni GnRH sono ancora poco noti. Abbiamo individuato una importante segnalazione da parte delle molecole Wnt sulla superficie dei bulbi olfattivi, importante per i collegamenti assonali, utilizzando una strategia combinata di colture organotipiche e topi transgenici reporter per b-catenina nucleare.
In assenza di Dlx5 osserviamo un chiaro fenotipo Kallmann nel topo. Quindi Dlx5 controlla qualche tappa precoce essenziale per lo sviluppo olfattivo e GnRH. Abbiamo generato i profili trascrizionali del tessuto olfattivo Dlx5-/- e condotto le relative analisi bioinformatiche (con Dr. Provero, Univ. Torino) per arrivare a individuare alcuni geni coding e microRNA coinvolti in questo processo. Recentemente stiamo adottando linee transgeniche del pesce zebra per visualizzare lo sviluppo olfattivo e ricavare dati funzionali su nuovi possibili geni Kallmann (con Dr. Santoro, Univ. Torino, Dr. Pitteloud, Lausanne CH).
Un valore aggiunto di queste ricerche risiede nel fatto che il tessuto sensoriale olfattivo è in grado di rigenerare gli elementi cellulari e i collegamenti assonali, a seguito di traumi o danni chimici parziali, che in altre zone del CNS e PNS risulta invece molto inefficiente se non assente. Nel lungo periodo, la conoscenza sulle network regolative importanti per lo sviluppo delle connessioni olfattive potrebbe avere implicazioni più generali per la biologia della rigenerazione e riparo delle lesioni al sistema nervoso.
- Giorgio Roberto Merlo
- Roberto Santoro
- Valentina Zamboni