Centro Interdipartimentale di Biotecnologie Molecolari "Guido Tarone"
Presso il Centro Interdipartimentale di Ricerca per le Biotecnologie Molecolari - MBC - dell’ Università di Torino sono presenti le seguenti infrastrutture di ricerca dedicate alla Stabulazione e al Trasferimento Genico. Le attrezzature sono state acquisite anche con il contributo di Regione Piemonte.
Topi e linee cellulari geneticamente modificati sono strumenti fondamentali in biomedicina. Negli ultimi anni sono stati compiuti incredibili progressi nelle tecnologie disponibili, consentendo un notevole salto di precisione, tempi e costi. Lo scopo del Servizio di trasferimento genico e mutagenesi è quello di generare sia topi geneticamente modificati utilizzando le cellule CRISPR Cas9 o ES, come appropriato, sia linee cellulari CRISPR Cas9-KO, e fornirle come servizio alla comunità scientifica.
Strutture
Il Servizio può contare, all'interno dello stabulario del Centro di Biotecnologie Molecolari, su una stanza dedicata dotata di gabbie filtrate e che ospita topi SPF per generare topi donatori e riceventi per gli esperimenti. Una stanza di colture cellulari dedicata alle Cellule ES consente la generazione efficiente di cellule ES geneticamente modificate. Due apparati di microiniezione consentono la microiniezione di zigoti e blastocisti. È anche possibile la elettroporazione di zigoti con Cas9 ricombinante e RNA guida.
La struttura offre la produzione di topi e linee cellulari geneticamente modificati sia per utenti interni che esterni.
Abbiamo recentemente introdotto il sistema CRISPR / Cas9 per generare topi KO e K/in, che consente un'efficienza senza precedenti (3-4 mesi rispetto a 1-1,5 anni con il tradizionale approccio di targeting genico basato su cellule ES). Inoltre, con questo sistema possono essere bersagliati contemporaneamente più geni. Complessivamente, queste funzionalità consentono di risparmiare circa un terzo del costo rispetto agli approcci basati su cellule ES.
Servizi
- Iniezione pronucleare in zigoti/preparazione del costrutto
- Mutagenesi basata su CRISPR / Cas9
- Targeting genico tradizionale basato su cellule ES
- Generazione di linee cellulari knock out o knock down
- Clonazione del DNA
Vengono utilizzati ceppi di topo allevati internamente C57BL/6 e FVB.
Il servizio include la pianificazione strategica tra cui strategie di screening, progettazione e generazione del costrutto, purificazione del DNA e microiniezione nel pronucleo maschile di 150 ovociti fecondati. Gli embrioni vengono trasferiti in madri adottive e le gravidanze vengono monitorate. I ricercatori ricevono quindi biopsie di coda da topi di 14 giorni per la genotipizzazione. Su richiesta, può anche essere eseguito il servizio di screening. I topi TG positivi verranno spediti a spese dell'utente, a 4 settimane di età.
CRISPR / Cas9 è rapidamente diventato l'approccio più ampiamente utilizzato per eseguire l'editing genico nei topi e nelle cellule. Si basa su un RNA guida progettato contro la regione da colpire e che contiene una sequenza riconosciuta e legata dalla proteina Cas9. Questo RNA guida Cas9 verso il DNA target, dove l'enzima introduce una rottura a doppio filamento in una regione precisa. L'interruzione viene quindi riparata tramite NHEJ (Non Homologous End Joining) o Homology Directed Repair (HDR), in presenza di un DNA donatore con sequenze omologhe. NHEJ è utilizzato per generare modelli KO, HDR per modelli K/in (di sostituzione).
Elettroporiamo direttamente Cas9 ricombinante e gli RNA guida in zigoti murini per generare topi KO, aggiungendo il DNA donatore per generare mutazioni di tipo K/in nei topi. Questa strategia consente di ottenere topi geneticamente modificati bypassando la necessità di manipolare le cellule ES, riducendo drasticamente il tempo richiesto (da tre a quattro mesi contro 1-1,5 anni) e i costi associati alla coltura di cellule ES.
Gli embrioni EP vengono quindi trasferiti chirurgicamente in madri adottive pseudoincinte, le gravidanze vengono monitorate e i cuccioli nati vengono sottoposti a biopsia della coda a 3 settimane di età. Le biopsie della coda sono genotipizzate tramite amplificazione PCR della regione bersaglio seguita da sequenziamento. I topini mutagenizzati vengono infine spediti al cliente.
Vengono generati tre diversi modelli:
• Topi KO mediante introduzione di mutazioni indel o delezioni specifiche.
• modelli K/in tramite microiniezione di un RNA guida e di un oligonucleotide a singolo filamento portatore della mutazione di interesse come DNA donatore.
• Possono essere implementate ulteriori alternative come le sostituzioni nucleotidiche mirate (da C a T o da G ad A) o il targeting genico condizionale mediante inserimento di siti loxP.
CRISPR / Cas9 è rapidamente diventato l'approccio più ampiamente utilizzato per eseguire l'editing genico nei topi e nelle cellule. Si basa su un RNA guida progettato contro la regione da colpire e che contiene una sequenza riconosciuta e legata dalla proteina Cas9. Questo RNA guida Cas9 verso il DNA target, dove l'enzima introduce una rottura a doppio filamento in una regione precisa. L'interruzione viene quindi riparata tramite NHEJ (Non Homologous End Joining) o Homology Directed Repair (HDR), in presenza di un DNA donatore con sequenze omologhe. NHEJ è utilizzato per generare modelli KO, HDR per modelli K/in (di sostituzione).
Elettroporiamo direttamente Cas9 ricombinante e gli RNA guida in zigoti murini per generare topi KO, aggiungendo il DNA donatore per generare mutazioni di tipo K/in nei topi. Questa strategia consente di ottenere topi geneticamente modificati bypassando la necessità di manipolare le cellule ES, riducendo drasticamente il tempo richiesto (da tre a quattro mesi contro 1-1,5 anni) e i costi associati alla coltura di cellule ES.
Gli embrioni EP vengono quindi trasferiti chirurgicamente in madri adottive pseudoincinte, le gravidanze vengono monitorate e i cuccioli nati vengono sottoposti a biopsia della coda a 3 settimane di età. Le biopsie della coda sono genotipizzate tramite amplificazione PCR della regione bersaglio seguita da sequenziamento. I topini mutagenizzati vengono infine spediti al cliente.
Vengono generati tre diversi modelli:
• Topi KO mediante introduzione di mutazioni indel o delezioni specifiche.
• modelli K/in tramite microiniezione di un RNA guida e di un oligonucleotide a singolo filamento portatore della mutazione di interesse come DNA donatore.
• Possono essere implementate ulteriori alternative come le sostituzioni nucleotidiche mirate (da C a T o da G ad A) o il targeting genico condizionale mediante inserimento di siti loxP.
Il targeting genico tradizionale nelle cellule staminali embrionali di topo (cellule ES) può essere ancora conveniente per la generazione di alleli mutanti condizionali, mediante l'inserimento di siti di riconoscimento per la ricombinasi Cre o Flip negli introni e la generazione di cosiddetti alleli “floxati” o “flippati”, completamente funzionali ma che possono essere deletati dalla rispettiva ricombinasi. Associato agli incroci con topi transgenici o all'infezione con vettori virali che esprimono la ricombinasi, è possibile ottenere l'inattivazione genica specifica in un dato tessuto oppure inducibile. Questi approcci richiedono lunghe regioni di omologia che finora non sono state utilizzate in modo efficiente nel sistema Cas9.
Il costrutto deve essere progettato con cura, parallelamente alla strategia di screening per distinguere tra alleli di tipo selvatico e mutanti. È necessario progettare e testare sperimentalmente sonde idonee per il DNA genomico.
Le regioni di omologia sono ricavate tramite ricombinazione omologa da un clone genomico BAC e combinate con siti LoxP o Flp e una cassetta per la resistenza alla Neomicina fiancheggiata da si lox o flp. Nel caso in cui il cliente abbia già un vettore, ci riserviamo di controllarne l'idoneità alle nostre condizioni.
Anche se è raro che non vengano identificati cloni ricombinanti, non possiamo garantire la generazione di cloni ricombinanti omologhi, poiché alcune regioni genomiche sembrano essere resistenti alla ricombinazione omologa.
Il vettore linearizzato sarà elettroporato in cellule ES, che saranno quindi sottoposte alla procedura di selezione appropriata. I cloni resistenti agli antibiotici saranno raccolti (minimo 200), espansi e analizzati tramite Southern blot genomico.
La Facility può generare vettori lentivirali adatti per entrambi gli scopi, incluso: clonazione delle sequenze per l'espressione dell'RNA guida o dell’shRNA, controllo tramite enzimi di restrizione e sequenziamento, generazione di virus ricombinante tramite infezione delle cellule 293T, infezione delle cellule fornite dal cliente . È inoltre possibile utilizzare plasmidi o virus forniti dal cliente.
Le linee cellulari KO tramite il sistema CRISPR/Cas9 saranno generate tramite infezione da vettori lentivirali che esprimono Cas9 e l'RNA guida opportunamente progettato, seguita da selezione e screening genetico. Possiamo anche generare i vettori. Risultati e costi dipenderanno dalla linea cellulare, si prega di informarsi.
Il silenziamento stabile mediato da shRNA sarà ottenuta tramite infezione con vettori lentivirali che esprimono shRNA adeguati, seguita da selezione. Lo screening mediante RT-PCR può essere fornito come servizio o eseguito dall'investigatore.
Qualsiasi tipo di clonazione può essere eseguita mediante approcci tradizionali oppure mediante ricombinazione nei batteri. Abbiamo una batteria dei plasmidi di clonazione più comuni. Nel caso siano necessari vettori non comuni, questi devono essere forniti dal cliente. Il servizio include la progettazione della strategia di clonazione, l'esecuzione della clonazione, la verifica dei cloni corretti mediante analisi delle restrizioni e il sequenziamento, se necessario. Su richiesta possono essere fornite quantità di DNA in scala maxi o midi.
Altri servizi, come produzione e purificazione di proteine ricombinanti, generazione e purificazione di anticorpi monoclonali, generazione e produzione di vettori AAV ricombinanti, possono anche essere forniti.
Tutti i prezzi sono su richiesta.
